Przygotowywanie pożywki dla roślinnych kultur in vitro
Kulturą in vitro nazywamy hodowlę komórek, tkanek, organów i całych roślin na syntetycznych podłożach w jałowych warunkach. Hodowlę takie prowadzi się najczęściej w naczyniach szklanych lub pojemnikach z tworzywa sztucznego, a w zależności od materiału roślinnego jaki stosujemy nazywamy je kulturami komórek, pędów, czy korzeni. Z uwagi na znacznie szybsze podziały komórkowe mikroorganizmów w stosunku do tempa podziałów komórek roślinnych w pracy bardzo ważne jest przestrzeganie wymogów bezwzględnej sterylności. Znanych jest wiele różnych pożywek stosowanych dla wzrostu izolowanych fragmentów roślin w warunkach in vitro, np. pożywka Murashige i Skoog (MS), Reinert i Mohr (RM), Tsuchiy (PB2), Quoirin i Lepoivre (QL), Fast (Fa) itp. Zawierają one wszystkie składniki odżywcze niezbędne dla wzrostu tkanek roślinnych w warunkach hodowli in vitro. W ich skład wchodzą makro i mikroelementy, źródło węgla w postaci cukru (najczęściej jest to sacharoza), witaminy (B1, B6, PP). Czasami uzupełniamy pożywki w różnego rodzaju ekstrakty, na przykład: ekstrakt słodowy, drożdżowy, peptobak, aminobak, stanowiące dodatkowe źródło azotu w formie amonowej, witamin i innych substancji. Stosowane jest także mleko kokosowe i ekstrakty z owoców lub warzyw. Czynnikiem zestalającym roztwory odżywcze jest agar - wyciąg z krasnorostów morskich (rodzaj Gelidium i Glacilaria) lub syntetyczne polisacharydy. Najistotniejszymi składnikami pożywki decydującymi o kierunku procesów wzrostu jak i regeneracji (tworzeniu organów przybyszowych pąków, korzeni) są hormony roślinne - auksyny, cytokininy, gibereliny i kwas abscysynowy. Stosowane są też związki modulujące endogenny poziom hormonów, blokujące receptory lub hamujące ich biosyntezę.
Wpływ hormonów roślinnych - kontrola
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu Nicotiana tabacum L po 2 miesiącach kultury - pożywka kontrolna MS. Na krawędziach cięcia blaszki liściowej pojawia się jedynie blado zielona tkanka kalusowa.
Wpływ hormonów roślinnych - cytokinina
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu (Nicotiana tabacum L.) po 2 miesiącach kultury - pożywka MS z 2 mg/L cytokininy - kinetyny. Pod wpływem wprowadzonej do pożywki kinetyny następuje regeneracja ogromnej liczby pąków z fragmentów blaszki liściowej.
Wpływ hormonów roślinnych - auksyna
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu (Nicotiana tabacum L.) po 2 miesiącach kultury - pożywka MS z 2 mg/L auksyny - NAA. Działanie auksyny obecnej w pożywce powoduje powstawanie tkanki kalusowej i korzeni przybyszowych.
Wpływ hormonów roślinnych - auksyna i cytokinina
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu (Nicotiana tabacum L.) po 2 miesiącach kultury - pożywka MS z 2 mg/L auksyny NAA i 4 mg/L cytokininy - kinetyny. Na pożywce zawierającej duże dawki auksyny i cytokininy regeneracja organów zostaje zahamowana, a powstaje jedynie tkanka kalusowa.
Bezpostaciowa tkanka kalusowa indukowana na fragmentach korzenia marchwi
Fragmenty mięsistego korzenia marchwi, zawierające kambium oraz otaczające je łyko i drewno, rosnące na pożywkach z auksyną (NAA lub IBA) tworzą kremowo-zieloną tkankę kalusową. Wzrost kalusa rozpoczyna się od podziałów kambium, a następnie dzielą się także niewykształcone komórki łyka i drewna. Jeśli dawka auksyny nie jest zbyt wysoka w kalusie różnicują się korzenie przybyszowe (widoczne na zdjęciu). Czasami po przeniesieniu kalusa na pożywki pozbawione hormonów następuje spontaniczne powstawanie somatycznych embrionów. Odcięta od eksplantatów matecznych tkanka kalusowa może dać początek tzw. kulturze zawiesinowej. Przeniesienie do pożywki płynnej fragmentów kalusa i intensywne wytrząsanie kultury powoduje mechaniczne rozbicie tkanki kalusowej i otrzymanie zawiesiny składającej się z pojedynczych komórek i mniejszych lub większych agregatów komórkowych. Kultury zawiesinowe marchwi stanowią modelowy system doświadczalny do badań procesu somatycznej embriogenezy.
Izolacja merystemów podkładki jabłoni M7
Przebieg mikrorozmnażania składa się z kilku etapów i obejmuje: inicjację czyli założenie kultury i jej stabilizację, rozmnażanie materiału roślinnego, ukorzenianie oraz aklimatyzację i adaptację w warunkach szklarniowych otrzymanych in vitro roślin. Każdy z wymienionych etapów ma odmienne wymagania dotyczące warunków prowadzenia hodowli, jak i kompozycji pożywki. W celu założenia kultury in vitro i wyizolowania jałowych eksplantatów odkaża się powierzchniowo materiał roślinny za pomocą ogólnie znanych środków dezynfekujących, - podchlorynu wapnia i sodu, wody utlenionej, wody bromowej, azotanu srebra, sublimatu itp. Po wypłukaniu materiału roślinnego w sterylnej wodzie destylowanej izolujemy fragmenty rośliny, organu lub tkanki (tzw. eksplantaty) w komorze z laminarnym przepływem powietrza. W wielu wypadkach najłatwiej zapoczątkować kulturę inokulując na pożywki wierzchołki wzrostu pędów lub jedynie merystemy wierzchołkowe lub boczne, które izolujemy przy użyciu mikroskopu stereoskopowego.
Rozwój pędów z izolowanych merystemów róży
Niektóre z wyciętych merystemów na odpowiednio zrównoważonych pożywkach rozwijają się w pędy. Odsetek merystemów podejmujących wzrost zależy od wielu czynników związanych ze stanem fizjologicznym rośliny, z której je izolujemy i składników chemicznych pożywki oraz warunków środowiskowych kultury.
Odkażone nasiona rosiczki pośredniej wysiane na pożywki kiełkują dając początek kulturze in vitro.
Podział pędów tytoniu i ich inokulacja na pożywce
Po założeniu kultury in vitro i zainicjowaniu wzrostu przez wyłożone na pożywkę merystemy lub wierzchołki pędów rozpoczynamy fazę klonalnego rozmnażania roślin. Polega ona na zwiększaniu liczby pędów, rozet, cebul przez stymulację rozwoju pąków bocznych, bądź na drodze regeneracji pąków przybyszowych lub embrionów somatycznych. Przebieg tych procesów zależy od odpowiednio dobranych dawek hormonów roślinnych (auksyny, cytokininy i gibereliny), które sterują regeneracją zarodków somatycznych, powstawaniem merystemów pędu i korzenia, stymulują rozwój pąków bocznych i wzrost łodyg. Uzyskane pędy dzieli się na fragmenty zawierające węzeł i przenosi ponownie na świeżą pożywkę.
Pędy goździka pysznego (Dianthus superbus L.) po wyszczepieniu na pożywkę
Wykładając wierzchołki pędów goździka pysznego (Dianthus superbus) na odpowiednie pożywki można stymulować rozwój od 10 do 20 pąków bocznych. Pędy rozwijają się z pąków kątowych 1-ego, 2-giego i następnych rzędów, a ich struktura przypomina czarcią miotłę.
Rozety rosiczki pośredniej inokulowane pojedynczo na pożywce o zmniejszonej do połowy zawartości makroelementów po kilku tygodniach rozmnażają się obficie przez rozwój pąków kątowych.
Proliferujące kultury podkładki jabłoni M7
Umieszczając wierzchołki pędów jabłoni lub podzielone pędy na pożywce (QL) zawierającej cytokinię (BA), auksynę (IBA) i giberelinę (GA) po 8 tygodniach kultury można uzyskać współczynnik proliferacji pędów 2 do 5.
Wiciokrzew pomorski (Lonicera periclymenum L.) w stadium rozmnażania
Rozmnażanie wiciokrzewu pomorskiego w kulturze in vitro następuje na skutek zainicjowania wzrostu pąków kątowych. Widoczne rozwinięte pędy boczne 1-szego, 2-giego i następnych rzędów.
Pęd wiciokrzewu pomorskiego (Lonicera periclymenum L.) przygotowany do ukorzeniania i pęd ukorzeniony na pożywce z auksyną
Większość rozmnażanych w warunkach in vitro gatunków wymaga etapu ukorzeniania. Odnosi się to przede wszystkim do drzew i krzewów oraz roślin, które w fazie rozmnażania prowadzone są na pożywkach z cytokininami. Fazę ukorzeniania przenieść można również bezpośrednio w niesterylne podłoże. Szereg czynników wpływa na efektywność ukorzeniania, można wymienić tu warunki świetlne, długość pędów, czas jaki upłynął od poprzedniego pasażu, stężenie soli mineralnych w pożywce i co najważniejsze obecność odpowiedniej dawki auksyny.
Ukorzenianie pędów podkładki jabłoni M7
Rozwój systemu korzeniowego podkładki jabłoni M7 na pożywce zawierającej 1,0 mg/L auksyny (IBA) po 3 tygodniach kultury.
Ukorzenianie Drosera capensis L.
Obniżenie stężenia makroelementów w pożywce poprawia zakorzenianie rozet rosiczki. Kolby kolejno od strony lewej, korzenie indukowane na: pożywce z pełnym stężeniem makroelementów MS, pożywce zawierającej 1/2 stężenia makroelementów MS oraz pożywce zawierającej 1/4 stężenia makroelementów.
Przenoszenie Drosera capensis L. z kultury in vitro do substratu torfowego
Przenoszonym w podłoże naturalne roślinom trzeba zapewnić odpowiednią wilgotność powietrza w szklarni. Na okres adaptacji do warunków szklarniowych umieszczamy rośliny w tunelach z folii polietylenowej. Stosowanie systemów zmgłaniania w boksach szklarniowych większa przeżywalność i tempo aklimatyzacji różnych gatunków. Po upływie 2 tygodni folie stopniowo odsłaniamy, a po następnych dwóch, trzech tygodniach całkowicie zdejmujemy. Prowadzenie różnych zabiegów hartowania w okresie kultury in vitro poprzedzającym przeniesienie do szklarni przyśpiesza podejmowanie wzrostu przez rośliny.
Kulturą in vitro nazywamy hodowlę komórek, tkanek, organów i całych roślin na syntetycznych podłożach w jałowych warunkach. Hodowlę takie prowadzi się najczęściej w naczyniach szklanych lub pojemnikach z tworzywa sztucznego, a w zależności od materiału roślinnego jaki stosujemy nazywamy je kulturami komórek, pędów, czy korzeni. Z uwagi na znacznie szybsze podziały komórkowe mikroorganizmów w stosunku do tempa podziałów komórek roślinnych w pracy bardzo ważne jest przestrzeganie wymogów bezwzględnej sterylności. Znanych jest wiele różnych pożywek stosowanych dla wzrostu izolowanych fragmentów roślin w warunkach in vitro, np. pożywka Murashige i Skoog (MS), Reinert i Mohr (RM), Tsuchiy (PB2), Quoirin i Lepoivre (QL), Fast (Fa) itp. Zawierają one wszystkie składniki odżywcze niezbędne dla wzrostu tkanek roślinnych w warunkach hodowli in vitro. W ich skład wchodzą makro i mikroelementy, źródło węgla w postaci cukru (najczęściej jest to sacharoza), witaminy (B1, B6, PP). Czasami uzupełniamy pożywki w różnego rodzaju ekstrakty, na przykład: ekstrakt słodowy, drożdżowy, peptobak, aminobak, stanowiące dodatkowe źródło azotu w formie amonowej, witamin i innych substancji. Stosowane jest także mleko kokosowe i ekstrakty z owoców lub warzyw. Czynnikiem zestalającym roztwory odżywcze jest agar - wyciąg z krasnorostów morskich (rodzaj Gelidium i Glacilaria) lub syntetyczne polisacharydy. Najistotniejszymi składnikami pożywki decydującymi o kierunku procesów wzrostu jak i regeneracji (tworzeniu organów przybyszowych pąków, korzeni) są hormony roślinne - auksyny, cytokininy, gibereliny i kwas abscysynowy. Stosowane są też związki modulujące endogenny poziom hormonów, blokujące receptory lub hamujące ich biosyntezę.
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu Nicotiana tabacum L po 2 miesiącach kultury - pożywka kontrolna MS. Na krawędziach cięcia blaszki liściowej pojawia się jedynie blado zielona tkanka kalusowa.
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu (Nicotiana tabacum L.) po 2 miesiącach kultury - pożywka MS z 2 mg/L cytokininy - kinetyny. Pod wpływem wprowadzonej do pożywki kinetyny następuje regeneracja ogromnej liczby pąków z fragmentów blaszki liściowej.
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu (Nicotiana tabacum L.) po 2 miesiącach kultury - pożywka MS z 2 mg/L auksyny - NAA. Działanie auksyny obecnej w pożywce powoduje powstawanie tkanki kalusowej i korzeni przybyszowych.
Wpływ hormonów roślinnych na regenerację izolowanych fragmentów blaszki liściowej tytoniu (Nicotiana tabacum L.) po 2 miesiącach kultury - pożywka MS z 2 mg/L auksyny NAA i 4 mg/L cytokininy - kinetyny. Na pożywce zawierającej duże dawki auksyny i cytokininy regeneracja organów zostaje zahamowana, a powstaje jedynie tkanka kalusowa.
Fragmenty mięsistego korzenia marchwi, zawierające kambium oraz otaczające je łyko i drewno, rosnące na pożywkach z auksyną (NAA lub IBA) tworzą kremowo-zieloną tkankę kalusową. Wzrost kalusa rozpoczyna się od podziałów kambium, a następnie dzielą się także niewykształcone komórki łyka i drewna. Jeśli dawka auksyny nie jest zbyt wysoka w kalusie różnicują się korzenie przybyszowe (widoczne na zdjęciu). Czasami po przeniesieniu kalusa na pożywki pozbawione hormonów następuje spontaniczne powstawanie somatycznych embrionów. Odcięta od eksplantatów matecznych tkanka kalusowa może dać początek tzw. kulturze zawiesinowej. Przeniesienie do pożywki płynnej fragmentów kalusa i intensywne wytrząsanie kultury powoduje mechaniczne rozbicie tkanki kalusowej i otrzymanie zawiesiny składającej się z pojedynczych komórek i mniejszych lub większych agregatów komórkowych. Kultury zawiesinowe marchwi stanowią modelowy system doświadczalny do badań procesu somatycznej embriogenezy.
Przebieg mikrorozmnażania składa się z kilku etapów i obejmuje: inicjację czyli założenie kultury i jej stabilizację, rozmnażanie materiału roślinnego, ukorzenianie oraz aklimatyzację i adaptację w warunkach szklarniowych otrzymanych in vitro roślin. Każdy z wymienionych etapów ma odmienne wymagania dotyczące warunków prowadzenia hodowli, jak i kompozycji pożywki. W celu założenia kultury in vitro i wyizolowania jałowych eksplantatów odkaża się powierzchniowo materiał roślinny za pomocą ogólnie znanych środków dezynfekujących, - podchlorynu wapnia i sodu, wody utlenionej, wody bromowej, azotanu srebra, sublimatu itp. Po wypłukaniu materiału roślinnego w sterylnej wodzie destylowanej izolujemy fragmenty rośliny, organu lub tkanki (tzw. eksplantaty) w komorze z laminarnym przepływem powietrza. W wielu wypadkach najłatwiej zapoczątkować kulturę inokulując na pożywki wierzchołki wzrostu pędów lub jedynie merystemy wierzchołkowe lub boczne, które izolujemy przy użyciu mikroskopu stereoskopowego.
Niektóre z wyciętych merystemów na odpowiednio zrównoważonych pożywkach rozwijają się w pędy. Odsetek merystemów podejmujących wzrost zależy od wielu czynników związanych ze stanem fizjologicznym rośliny, z której je izolujemy i składników chemicznych pożywki oraz warunków środowiskowych kultury.
Odkażone nasiona rosiczki pośredniej wysiane na pożywki kiełkują dając początek kulturze in vitro.
Po założeniu kultury in vitro i zainicjowaniu wzrostu przez wyłożone na pożywkę merystemy lub wierzchołki pędów rozpoczynamy fazę klonalnego rozmnażania roślin. Polega ona na zwiększaniu liczby pędów, rozet, cebul przez stymulację rozwoju pąków bocznych, bądź na drodze regeneracji pąków przybyszowych lub embrionów somatycznych. Przebieg tych procesów zależy od odpowiednio dobranych dawek hormonów roślinnych (auksyny, cytokininy i gibereliny), które sterują regeneracją zarodków somatycznych, powstawaniem merystemów pędu i korzenia, stymulują rozwój pąków bocznych i wzrost łodyg. Uzyskane pędy dzieli się na fragmenty zawierające węzeł i przenosi ponownie na świeżą pożywkę.
Wykładając wierzchołki pędów goździka pysznego (Dianthus superbus) na odpowiednie pożywki można stymulować rozwój od 10 do 20 pąków bocznych. Pędy rozwijają się z pąków kątowych 1-ego, 2-giego i następnych rzędów, a ich struktura przypomina czarcią miotłę.
Rozety rosiczki pośredniej inokulowane pojedynczo na pożywce o zmniejszonej do połowy zawartości makroelementów po kilku tygodniach rozmnażają się obficie przez rozwój pąków kątowych.
Umieszczając wierzchołki pędów jabłoni lub podzielone pędy na pożywce (QL) zawierającej cytokinię (BA), auksynę (IBA) i giberelinę (GA) po 8 tygodniach kultury można uzyskać współczynnik proliferacji pędów 2 do 5.
Rozmnażanie wiciokrzewu pomorskiego w kulturze in vitro następuje na skutek zainicjowania wzrostu pąków kątowych. Widoczne rozwinięte pędy boczne 1-szego, 2-giego i następnych rzędów.
Większość rozmnażanych w warunkach in vitro gatunków wymaga etapu ukorzeniania. Odnosi się to przede wszystkim do drzew i krzewów oraz roślin, które w fazie rozmnażania prowadzone są na pożywkach z cytokininami. Fazę ukorzeniania przenieść można również bezpośrednio w niesterylne podłoże. Szereg czynników wpływa na efektywność ukorzeniania, można wymienić tu warunki świetlne, długość pędów, czas jaki upłynął od poprzedniego pasażu, stężenie soli mineralnych w pożywce i co najważniejsze obecność odpowiedniej dawki auksyny.
Rozwój systemu korzeniowego podkładki jabłoni M7 na pożywce zawierającej 1,0 mg/L auksyny (IBA) po 3 tygodniach kultury.
Obniżenie stężenia makroelementów w pożywce poprawia zakorzenianie rozet rosiczki. Kolby kolejno od strony lewej, korzenie indukowane na: pożywce z pełnym stężeniem makroelementów MS, pożywce zawierającej 1/2 stężenia makroelementów MS oraz pożywce zawierającej 1/4 stężenia makroelementów.
Przenoszonym w podłoże naturalne roślinom trzeba zapewnić odpowiednią wilgotność powietrza w szklarni. Na okres adaptacji do warunków szklarniowych umieszczamy rośliny w tunelach z folii polietylenowej. Stosowanie systemów zmgłaniania w boksach szklarniowych większa przeżywalność i tempo aklimatyzacji różnych gatunków. Po upływie 2 tygodni folie stopniowo odsłaniamy, a po następnych dwóch, trzech tygodniach całkowicie zdejmujemy. Prowadzenie różnych zabiegów hartowania w okresie kultury in vitro poprzedzającym przeniesienie do szklarni przyśpiesza podejmowanie wzrostu przez rośliny.